Secreção ocular amarela de cachorro


A secreção do olho amarelo em cães (DDE) é uma doença comum em cães ([@ bib1], [@ bib2]). Embora uma variedade de terapias sejam usadas para tratar a doença, sua eficácia não é alta ([@ bib3]). Recentemente, muitos estudos examinaram o mecanismo patogênico da DDE, e o seguinte foi relatado.

O fator de necrose tumoral-α (TNF-α), uma citocina, é produzido por várias células em resposta à reação antígeno-anticorpo, estresse oxidativo ou estimulação por citocina. O TNF-α possui as três propriedades a seguir. Primeiro, tem várias atividades biológicas, como a promoção de respostas inflamatórias ([@ bib4]), o aumento da permeabilidade vascular ([@ bib5]) e o aumento da fibrose ([@ bib6]). Além disso, o TNF-α é uma das citocinas mais potentes que causam diretamente a morte celular ([@ bib7]). Em segundo lugar, o TNF-α ativa a via do fator nuclear-κB (NF-κB) e a via da proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK). A ativação de NF-κB induz a expressão de vários genes, tais como óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e ciclooxigenase-2 (COX-2) ([@ bib8]). Portanto, o NF-κB ativado é considerado como promotor da morte celular em várias células ([@ bib9]). Terceiro, o TNF-α ativa a via da caspase ([@ bib10]). A via da caspase inclui dois tipos diferentes: tipo I e tipo II. A via do tipo I consiste em caspase 8, caspase 10 e caspase 3. A via do tipo II inclui a caspase 9, que é induzida pela clivagem da caspase 8. Essas vias levam à apoptose ([@ bib11]). Além disso, o TNF-α desempenha um papel central em várias respostas inflamatórias e imunes e, portanto, está intimamente associado a doenças autoimunes, como a artrite reumatóide ([@ bib12]) e doenças infecciosas, como a malária ([@ bib13]) e tularemia ([@ bib14]). Em cães, foi relatado que o TNF-α é expresso no sangue, pele e fluido sinovial em cães com artrite induzida por antígeno ([@ bib15]).

No entanto, o envolvimento de TNF-α em DDE não foi relatado. Para investigar o papel do TNF-α no DDE, este estudo tem como objetivo examinar a expressão do TNF-α no sangue, células epidérmicas e derme no DDE.

MATERIAIS E MÉTODOS

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Cães

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Um total de 7 cães Shiba Inu japoneses saudáveis ​​(4 machos e 3 fêmeas, de 1 a 5 anos de idade) foram usados ​​para este estudo. O peso corporal variou de 10 a 24 kg. Todos os cães foram mantidos de acordo com as diretrizes de boas práticas veterinárias. Os proprietários dos cães forneceram consentimento informado por escrito para serem incluídos neste estudo.

Lesões DDE

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Os sinais clínicos foram presença de secreção, pápulas e ulcerações na pele. Os cães foram examinados por um dermatologista credenciado (Y.T.). Após a observação dos sinais clínicos, os cães foram tratados com prednisolona oral (3 mg / kg, uma vez ao dia durante 2 semanas). Todos os cães apresentaram os mesmos sinais clínicos e a mesma resposta ao tratamento.

Anticorpo

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O anticorpo anti-TNF-α (anticorpo anti-TNF-α, clone 1B7, Abcam plc) foi preparado conforme descrito no protocolo de anticorpo e imunohistoquímica.

Ensaio de proteína TNF-α

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As amostras de sangue foram obtidas da veia jugular, e as células epidérmicas e derme foram obtidas da pele da coxa de cada cão. O TNF-α foi medido usando o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e o ensaio citotóxico (kit ELISA para TNF humano, Endogen, Woburn, MA). As amostras de sangue foram obtidas antes do tratamento. As células epidérmicas e a derme foram obtidas imediatamente após a cirurgia. As amostras foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e armazenadas a -80 ° C até o uso. Após o descongelamento, as amostras foram homogeneizadas. A proteína TNF-α foi medida usando o kit ELISA.

Imunohistoquímica

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Seções congeladas foram preparadas a partir da pele. Os cortes congelados foram cortados em uma espessura de 5 μm, montados em lâminas de vidro, r-dry, fixados com paraformaldeído 4% por 20 minutos e, em seguida, bloqueados com soro de cabra 3%. Em seguida, as lâminas foram incubadas com o anticorpo anti-TNF-α (1: 100) por 16 horas a 4 ° C. As lâminas foram lavadas 3 vezes com PBS durante 10 minutos de cada vez. Em seguida, as lâminas foram incubadas com um anticorpo secundário (cabra anti-IgG de camundongo, Alexa Fluor 555, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) por 1 hora a 37 ° C, lavadas 3 vezes com PBS por 10 minutos de cada vez e montadas com meio de montagem contendo 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA). Um microscópio de fluorescência (BZ-8000, Keyence Corp, Osaka, Japão) foi usado para observar as lâminas.

As células epidérmicas e a derme foram embebidas em composto de temperatura de corte ideal (O.C.T) e foram preparadas para seções congeladas. Os cortes foram cortados com espessura de 5 µm, montados em lâminas de vidro, fixados com paraformaldeído 4% por 20 minutos e bloqueados com soro de cabra 3%. Em seguida, as lâminas foram incubadas com o anticorpo anti-TNF-α (1: 100) por 16 horas a 4 ° C. As lâminas foram lavadas 3 vezes com PBS por 10 minutos de cada vez


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